<p dir="auto">ПЛР складається з багатьох послідовних етапів, і на кожному з них можуть виникнути певні проблеми. Якщо результат неочікуваний або сумнівний, саме контрольні проби допомагають швидко локалізувати проблему і зрозуміти, на якому етапі вона виникла. В даній статті ми розглянемо їх детальніше.</p>
<p dir="auto"><strong>Негативний контроль (No Template Control, NTC)</strong></p>
<p dir="auto">Це реакція, що містить усі компоненти ПЛР — полімеразу, праймери, нуклеотиди, буфер — але без цільового фрагмента нуклеїнової кислоти. Якщо в цьому зразку раптом з’являється ампліфікація, це означає, що реактиви або обладнання забруднені сторонньою ДНК/РНК. У такому разі отримані результати слід вважати недійсними.</p>
<p dir="auto"><strong>Позитивний контроль</strong></p>
<p dir="auto">Це реагент, який гарантовано містить цільовий фрагмент у відомій концентрації (або принаймні його наявність). Якщо він не ампліфікується, можливі причини:</p>

<ul dir="auto">
 	<li>Пошкоджені чи прострочені реагенти,</li>
 	<li>Неправильні умови ПЛР,</li>
 	<li>Несправність термоциклера.</li>
</ul>
<p dir="auto">Позитивний контроль підтверджує, що реакція в принципі здатна працювати і дає сигнал за зазначених налаштувань ампліфікатора.</p>
<p dir="auto"><strong>Внутрішні контролі (Internal Controls)</strong></p>
<p dir="auto">Внутрішні контролі це додаткові фрагменти (ендо- чи екзогенні), які ампліфікуються одночасно з цільовим фрагментом. Вони перевіряють коректність реакції у кожній пробірці, використовуючи той самий буфер, dNTP та фермент, що і цільовий фрагмент.</p>
<p dir="auto"><strong>Ендогенний внутрішній контроль</strong></p>

<ul dir="auto">
 	<li>Це зазвичай стабільно наявний у зразку ген (наприклад, β-актин у людини).</li>
 	<li>Демонструє, чи якісно виділена нуклеїнова кислота та чи відсутні інгібітори, що заважають ампліфікації.</li>
</ul>
<p dir="auto"><strong>Екзогенний внутрішній контроль</strong></p>

<ul dir="auto">
 	<li>Штучно введений фрагмент нуклеїнової кислоти, якої немає в зразку від початку.</li>
 	<li>Зазвичай додається на етапі екстракції, тому дозволяє виявляти проблеми не лише із самою ПЛР, а й із процедурою виділення ДНК/РНК.</li>
 	<li>Виробники тест-систем підбирають кількість такого контролю та праймерів, щоб він не «забивав» ампліфікацію цільового фрагмента й не спотворював результати.</li>
</ul>
<p dir="auto"><strong>Ct (Cycle threshold) із погляду виробників тест-систем</strong></p>
<p dir="auto">У ПЛР у реальному часі (qPCR) флуоресцентний сигнал фіксується після кожного циклу ампліфікації.</p>

<ul dir="auto">
 	<li>Ct (Cycle threshold) — це номер циклу, на якому рівень флуоресценції перетинає певний поріг.</li>
 	<li>Виробники тест-систем, як правило, надають чіткі рекомендації, у яких межах циклів (наприклад, до 35–38) результат вважається достовірним. Показники вище цих меж можуть вказувати на дуже низьку кількість цільового фрагмента або на технічні артефакти.</li>
 	<li>Слід одночасно оцінювати Ct для цільового фрагмента і для внутрішнього контролю, щоб переконатися в належній роботі реакції в кожній конкретній пробірці.</li>
</ul>
<p dir="auto"><strong>Кількісні стандарти</strong></p>
<p dir="auto">Коли потрібно знати концентрацію цільового фрагмента (наприклад, для оцінки вірусного навантаження), до ПЛР включають стандартні зразки з відомою кількістю копій. Порівнюючи отриманий Ct із Ct стандартів, ви може розрахувати реальну кількість копій у зразку. Це допомагає у:</p>

<ul dir="auto">
 	<li>Моніторингу перебігу хвороби,</li>
 	<li>Оцінці ефективності терапії,</li>
 	<li>Аналіз рівня експрессії генів</li>
</ul>
<p dir="auto"><strong>Система контролів — невід’ємна частина надійного ПЛР-протоколу. </strong>Ми рекомендуємо обирати тест-системи, що містять екзогенний внутрішній контроль, адже це дозволить вам оцінити не лише якість ампліфікації, а й перевірити ефективність екстракції.</p>
<p dir="auto">Також звертайте увагу на валідацію тест-систем виробником, їх підтверджену чутливість і специфічність. Наявність детальних інструкцій із використання та рекомендацій щодо оптимальних умов реакції допоможе дотримуватися протоколу й отримувати надійні та відтворювані результати.</p>